Práctica 14: Rubeóla IgG ELISA

RUBEÓLA

Objetivo

El objetivo de esta práctica es medir la concentración de IgG en nuestra muestra problema

Fundamento

El fundamento de la prueba consiste en utilizar una placa microtiter que contiene los pocillo recubiertos de Ag rubéla y ver si los Ac se unen a ellos y forman el complejo Ag-Ac.

Significado clínico

La rubéola es una enfermedad exantemática aguda leve de niños y adultos, moderadamente contagiosa. Cuando la enfermedad es adquirida por la gestante dentro de los cuatro primeros meses de embarazo, el virus puede infectar al feto y causarle serias malformaciones. Igualmente puede producir complicaciones severas en los adultos. 

Materiales

• Porta placas

• Pipetas automáticas

• Puntas de pipetas desechables

• Microtiras de IgG recubiertas de Ag de rubeóla 

Muestra 

• Suero o plasma

Reactivos

• Calibradores de la A-E (sueros humanos diluidos con PBS) ( 0-10-50-200-500 unidades internacionales/mL correspondientemente)

• Conjugado de IgG Anti-humano (15 mL) 
• Sustrato
• Solución de parada
• Solución diluyente para la muestra
• Solución de lavado 10x

Aparataje 

• Lector de placas de ELISA

Procedimiento

- Preparación de reactivos

1. Preparamos la solución de lavado al 1/9
2. Diluimos la muestra al 1/101

- Técnica

1. Preparamos el porta placas donde ira la microtira. En el pocillo 1 se encontrara el blanco, en los pocillos del 2 al 6 irán los calibradores y en el último pocillo irá la muestra

2. Pipeteamos 100 microlitros en los pocillos 2,3,4,5 y 6 los correspondientes calibradores de la A a la E

3. En el pocillo tres pipeteamos 100 microlitros de la muestra diluida al 1/101

4. Tapamos la mezcla e incubamos durante 60 minutos a Tª ambiente

5. Después de incubar, volcamos de la microtira el líquido de los pocillos

6.Lavamos 3 veces con 300 microlitros de solución de lavado en cada pocillo. Debemos intentar que no rebosen los pocillos. Para lavar, pipeteamos 300 microlitros de solución de lavado en el pocillo, resuspendemos y desechamos

7. Pipeteamos 100 microlitros de conjugado Anti-IgG en todos los pocillos, menos en el pocillo del blanco

8.Tapamos e incubamos durante 30 minutos a Tª ambiente

9. Volvemos a lavar otras 3 veces con 300 microlitros de solución de lavado a cada pocillo

10. Pipeteamos 100 microlitros de sustrato en todos los pocillo, incluido el pocillo del blanco

11. Tapamos e incubamos 20 minutos a Tª ambiente en la oscuridad

12. Pipeteamos 100 microlitros de solución de parada en cada pocillo, incluido el blanco

13. Leemos la absorbación a 450 o 620 nm. El color es estable durante 60 minutos

Lectura y resultados

- Efectuamos con el blanco del primer pocillo la calibración a 0 del lector ELISA

- Medimos la absorbancia de todos los pocillos a 450 nm

- Anotamos los resultados, que han sido:

Blanco: 0,118

Pocillo 1: 0,009

Pocillo 2: 0,312

Pocillo 3: 0,453 

Pocillo 4: 0,718

Pocillo 5: 1,383

Pocillo 6: 0,847

- Como el blanco no da 0, restamos su valor a todos los demás pocillos

Blanco: 0,118 

Pocillo 1: 0,009 - 0,118= Como sale negativo, lo contamos como 0

Pocillo 2: 0,312 - 0,118= 0,194

Pocillo 3: 0,453 - 0,118= 0,335

Pocillo 4: 0,718 - 0,118= 0,6

Pocillo 5: 1,383 - 0,118= 1,265

Pocillo 6:0,847 - 0,118= 0,729

- Para obtener resultados cuantitativos en unidades internacionales por mL se realiza una curva de calibración con la absorbancia en el eje y y la concentración en el eje X y por extrapolación sacamos la línea y unimos los puntos. 

Gráfica: