Práctica 13: Identificación de proteínas por inmunoelectroforesis

Identificación de proteínas por inmunelectroforesis

Objetivo

El objetivo de esta práctica es separar las proteínas contenidas en un suero e identificar en él la posible presencia de Albúmina e IgG

Fundamento

La inmunoelectroforesis es una técnica de separación e identificación de sustancias (habitualmente proteínas) que atraviesa dos fases. Durante la primera fase, separamos las proteínas de la muestra mediante una electroforesis convencional en agarosa. En la segunda fase, se practica un carril o canal paralelo al recorrido electroforético y se rellena con un Ac antiproteína adecuado. La difusión del Ag (proteína) y del Ac (suero antiproteína) permitirá que ambos se unan y reaccionen entre sí formando un complejo Ag-Ac que se hará visible en forma de unos arcos de precipitación.

Significado clínico

El significado clínico de la práctica es poder identificar la posible presencia de Albúmina e IgG.

Materiales

• Molde para los carriles ( 4 portas y una placa de petri)

• Cubeta y molde para el gel de agarosa

• Fuente de alimentación

• Pipetas pasteur 

• Micropipetas automáticas

• Puntas de pipetas desechables

Muestra

• IgG (Ag) (A)
• Suero sanguíneo (Ag) (B)
• Albúmina (Ag) (C)
• Anticuerpos frente al suero (D)
• Anticuerpos frente a la IgG (E)

Reactivos

• Agarosa en polvo

• Tampón de electroforesis concentrado (25x)

Aparataje

• Microondas

• Baño termostático

Procedimiento

- Preparación del tampón y el gel de electroforesis

1. Preparamos el tampón de electroforesis diluyendo 38 mL del bote que lo contiene concentrado en 912 mL de agua destilada para obtener un volumen final de 950 mL. Este tampón se usará para preparar la agarosa y realizar la electroforesis.
2. Para preparar el gel de agarosa:

- Añadimos 1 gramo de agarosa a 100 mL de tampón anteriormente preparado

- Ponemos un tapón de papel al erlenmeyer (que contiene la mezcla) y lo metemos en el microondas hasta disolver la agarosa totalmente, aproximadamente 1 minuto a máxima potencia. 

Al final la solución debe ser transparente y no debe contener partículas sin disolver

- Enfriamos la solución hasta 60ºC en un baño termostático. 

*Si vemos que se ha evaporizado mucha mezcla, añadimos agua destilada.

- Preparación del gel

1. Añadimos la mezcla de agarosa a un molde y hacemos los carriles con sus correspondientes moldes
2. Dejamos que solidifique
3. Cuando esté solificado, extraemos cuidadosamente el molde para los carriles

- Realización de la electroforesis

1. Haz los pocillos en el gel con ayuda de una pipeta pasteur. Para hacerlos, nos fijamos en la plantilla y extremamos la precaución dejando 0,5 cm de distancia entre los pocillos y los carriles
2. Colocamos la bandeja con el gel en la cubeta de electroforesis y ponemos el papel de filtro en cada uno de los extremos de manera que sobresalga hacia el exterior. Dicho papel deberá estar empapado con el tampón
3. Vertimos el tampón en los vasos de la cubeta de electroforesis hasta llenarlos. No debemos cubrir el gel con el tampón
4. Dispensamos 20 microlitros de cada Ag en los pocillos correspondientes (A en el superior, B en el central y C en el inferior). *
5. Cerramos la tapa de la cubeta y conectamos los electrodos respetando la polaridad y teniendo en cuenta que los Ag a identificar están cargados negativamente.
6. Conectamos la cubeta a la fuente de alimentación y aplicamos un voltaje de 125 V durante unos 30-45 minutos. 
7. Cuando finalice la electroforesis, desconectamos la fuente de alimentación y quitamos la tapa. Retiramos el papel de filtro y extraemos de la cubeta el gel . 

*Hubo un pequeño error y además de llenar los pocillos, también llenaron los carriles (aunque no todos)

- Difusión de los Ag y Ac

1. Añadimos 50 microlitros de cada Ac en el carril correspondiente. Dispensamos el Ac procurando que se distribuya por todo el carril
2. Colocamos la bandeja con el gel en una cámara húmeda
3. Tras 24-48 hora de difusión, serán visibles los arcos de precipitación en el gel

Lectura y resultados