Práctica 12: Interacción antígeno-anticuerpo. El procedimiento ouchterlony

el
Interacción Ag-Ac. El procedimieto ouchterlony

Objetivo
El objetivo se este experimento es introducir los principios de las interacciones antígeno-anticuerpo usando el procedimiento Ouchternoly.

Fundamento
La mayoría de los Ag son proteínas. La identidad exacta de lo grupos que reaccionan con el Ac generalmente no se conoce. Los Ag macromoleculares y los Ac forman complejos que se vuelven insolubles y precipitan. Esta propiedad hace posible hace posible realizar ensayos cualitativos y cuantitativos en el sistema Ag-Ac. 

Significado clínico
En cuanto al procedimiento Ouchternoly, las soluciones Ag y Ac se colocan en pocillos separados cortados en una placa de agarosa. Los reactivos se difunden desde los pozos uno hacia el otro y precipitan donde se encuentran en proporciones equivalentes. Un único Ag se combinará con su Ac homólogo para formar una única línea de precipitación. Cuando dos Ag están presentes, cada uno se comporta independientemente el uno del otro. Por lo tanto, el número de bandas de precipitación indica que hay al menos muchos pares de Ac y Ag presentes. Las flechas indican patrones de difusión de Ag y Ac. 

Materiales
  • Micropipetas automáticas de 30 microlitros

  • Puntas de pipetas desechables

  • Pipetas pasteur

  • Placas petri

  • Plantilla


Muestra
  • Antisuero
  • Suero total (Ac)
  • Albúmina
  • IgG



Reactivos
  • Agarosa
  • Tampón en polvo


Aparataje
  • Microondas

  • Baño termostático

  • Cámara húmeda


Procedimiento
- Preparación de anticuerpos y antígenos
  1. El Ac y los tres Ag vienen repartidos en 4 tubos, y lo que vamos a hacer es alicuotarlos para todos los grupos.
  2. Identificamos los tubos: 10 tubos A, 10 tubos B, 10 tubos C y 10 tubos D
  3. Alicuotamos:
- En cada tubo A: 100 microlitros de la muestra A (antisuero)
- En cada tubo B: 200 microlitros de la muestra B (Suero total)
- En cada tubo C: 150 microlitros de la muestra C (Albúmina)
- En cada tubo D: 80 microlitros de la muestra D (IgG)



- Preparación de agarosa y de placas de Ouchternoly
Para preparar la agarosa:
  1. En un matraz de 500 mL añadimos todo el contenido del sobre del tampón en polvo a 225 mL de agua destilada y agitamos para disolver el polvo.
  2. Añadimos toda la agarosa al matraz y agitamos para que no haya grumos
  3. Calentamos la disolución para disolver la agarosa. Mientras se va calentando en el microondas, la vamos sacando y la mezclamos. Debe quedar clara y transparente. La mantenemos en el microondas aproximadamente durante 2 minutos.
  4. Enfriamos la solución a unos 55ºC en el baño termostático




Para preparar las placas Ouchternoly:
  1. Cada grupo necesita 3 placas, en las que depositaremos 5 mL e la agarosa líquida anteriormente preparada. Cubrimos la totalidad de la placa y quitamos las posibles burbujas con una punta de pipeta
  2. Dejamos que solidifique aproximadamente unos 10-15 minutos, hasta que la agarosa se vea de manera opaca

- Preparación de los pocillos para las muestras
  1. Colocamos la placa sobre la plantilla
  2. Cortamos la punta de la pipeta pasteur para poder hacer los pocillos
  3. Con mucho cuidado introducimos la pipeta (ya presionada) en la placa de agarosa y hacemos el pocillo. Cuando lo tengamos hecho, soltamos la pipeta y por vacío el gel subirá y tendremos el pocillo
  4. Si en algún caso hacemos el pocillo y no podemos retirar el gel, nos podemos ayudar de una aguja para poder quitarlo




- Carga de las muestras en los pocillos
  1. Anotamos la identificación de nuestro grupo en la parte de arriba de la placa y en los laterales la letra del tubo de reactivo que vamos a añadir al gel
  2. Como vamos a hacer tres placas distintas, nos la repartimos y en este caso a mi me ha tocado la placa número 1:
- Pocillo central: 30 microlitros de antisuero (tubo A)
- Pocillo superior izquiedo: 30 microlitros de suero entero (tubo B)
- Pocillo superior derecho: 30 microlitros de suero entero (tubo B)
- Pocillo inferior izquierdo: 30 microlitros de suero entero (tubo B)
- Pocillo inferior derecho: 30 microlitros de suero entero (tubo B)





** Debemos tener cuido con derramar ni muestra ni reactivo, ya que puede interferir en la reacción.

- Incubación
Para preparar la cámara de incubación:
  1. Cubrimos los recipientes de plástico con varias hojas de papel y las mojamos con agua destilada. No debe haber ninguna capa de líquido sobre los papeles
  2. Encima ponemos una hoja de papel de filtro y añadimos un poco de agua
  3. Colocamos las placas, ya tapadas, en filas de tres y con mucho cuidado
  4. Tapamos la cámara con varias capas de papel de aluminio y ponemos cinta carrocera alrededor para que no se despegue
  5. Guardamos las cámaras y dejamos las placas incubar durante 24-48 horas




Lectura y resultados
  




Comentarios

Publicar un comentario