Determinación de título anti-SLO
Objetivo
El objetivo de esta práctica es la determinación cuantitativa del título de antiestreptolisina-O
Fundamento
La estreptolisina-O (SLO) liofilizada, es un procedente del cultivo de estreptococos beta-hemolíticos. Se trata de un producto estandarizado para la determinación cuantitativa de antiestreptolisina- O, por la técnica de inhibición de la hemólisis.
Significado clínico
El carácter inmunogénico de la SLO permite valorar la extensión de una infección estreptocócica, por simple titulación del nivel en suero de anticuerpos anti-SLO. Diluciones crecientes del suero problema se enfrentan con una cantidad constante de SLO, en presencia de una suspensión de hematíes, determinándose la dilución de suero más alta capaz de inhibir el poder hemolítico de la toxina. La inversa de dicha dilución corresponde al título del suero.
Materiales
- Microplaca con pocillos "U"
- Micropipetas de 50 y 25 microlitros
- Puntas de pipetas desechables
Muestra
- Suero fresco
Reactivos
- Tampón
- Estreptolisina O
- Hematíes al 3% grupo 0 (serán del grupo 0, ya que como no tienen Ag de superficie, no intervienen en la reacción contra la SLO y los Ac anti-SLO)
Aparataje
- Estufa
Procedimiento
- Micrométodo
1.Preparamos una suspensión de hematíes lavados: 5 mL de suspensión de hematíes + 95 mL de tampón fosfato
2.Diluimos el suero del paciente:
- 0,2 mL de suero + 1,8 mL de tampón (1/10)
- 0,1 mL de suero + 2,4 mL de tampón (1/25)
3. Preparamos la estrptolisina O con 500 microlitros de SLO + 15 mL de agua destilada
4. Utilizaremos 2 filas de la placa (A y B), cada una con 10 pocillos ( siendo el pocillo 10, un pocillo de control):
- Fila A
- Añadimos 50 microlitros de tampón del 1 al 10
- Añadimos 50 microlitros de suero del paciente diluido al 1/10 solo al primer pocillo, y vamos haciendo diluciones de 50 microlitros hasta el pocillo 9, donde desechamos los últimos 50 microlitros
- Añadimos 25 microlitros de disolución SLO a los pocillos del 1 al 10
- Agitamos y metemos la placa en la estufa a 37ºC durante 15 minutos
- Añadimos 25 microlitros de la suspensión de hematíes al 3% a todos los pocillos ( 1 al 10)
- Agitamos y metemos la placa de nuevo en la estufa durante 45 minutos a 37ºC. A los 15 minutos, la sacamos para agitar y volvemos a la estufa los 30 minutos restantes.
-Fila B
- Añadimos 50 microlitros de solución tampón a todos los pocillos ( 1 al 10)
- Añadimos 50 microlitros de suero del paciente diluido al 1/25 solo al primer pocillo y vamos haciendo diluciones de 50 microlitos hasta el pocillo 9, donde desechamos los últimos 50 microlitros
- Añadimos 25 microlitos de dilución SLO del 1 al 9
- Agitamos y metemos en la estufa a 37ºC durante 15 minutos
- Al salir, añadimos 25 microlitos de la suspensión de hematíes al 3% a todos los pocillos (1 al 10)
- Agitamos y metemos en la estufa 45 minutos a 37ºC. A los 15 minutos de estar en la estufa, la sacamos y la agitamos y volvemos a meterla los 30 minutos restantes.
5. Sacamos la placa y la dejamos reposar 60 minutos a Tª ambiente para poder leerla.
Lectura y resultados
Lo que queremos hacer con esta práctica es medir la inhibición de la hemólisis. La SLO se encarga de lisar los hematíes.
Al pocillo le añadimos SLO, el suero problema y los hematíes; si en el suero hay Ac contra los Ag de SLO, se formaran complejos y los hematíes quedaran libres y no habrá hemólisis.
Al ir haciendo diluciones, se van agotando los Ac del suero problema y no hay uniones Ag-Ac, así que si habrá hemólisis.
Si no hay hemólisis es positivo y si la hay es negativo.
-Fila A
Es negativo en los pocillos del 1 al 6 (hay hemólisis) y positivo en los pocillos del 7 al 8 ( no hay hemólisis), pero no es correcta porque el pocillo 10 debería ser negativo y es positivo, así que no nos vale para leerlo.
El posible error ha podido ser de pipeteo o que hemos añadido algo que no debíamos añadir.
-Fila B
Es negativo en los pocillos del 1 al 4 ( hay hemólisis) y positivo en los pocillos del 5 al 9 y además el pocillo 10 también sale, así que podemos leerla.
La dilución máxima en la que hay hemólisis es 1/400.
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