Práctica 8: Determinación cualitativa de anticuerpos anti-Treponema pallidum (TPHA- Hemaglutinación en microplaca)

Determinación cualitatica de anticuerpos anti-Treponema (TPHA)

Objetivo

El objetivo del método es la detección de anticuerpos específicos anti-Treponema pallidium

Fundamento 

El TPHA es una prueba de hemoaglutinación indirecta en microplacapara la detección cualitativa y semicuentitativva de anticuerpos específicos anti- Treponema pallidium en suero humano. Los hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con una solución antigénica de T.pallidium, aglutinan en presencia de acnticuerpos anti-pallidium mostrando unos patrones de aglutinación característicos.
La sífilis es una enfermedad venérea provocada por la infección con T.pallidum. La transmisión del microorganismo se produce por contacto directo a través de una lesión productiva. El periodo de incubación es de 20 días y la enfermedad progresa a través de 3 fases distintas con sintomatología diferente. Los anticuerpos anti-Treponema aparecen a partir de la primera fase y pueden permanecer en un 85-90% de pacientes tratados a pesar de haber superado la enfermedad. 

Materiales

• Microplaca con fonfo en "U"

• Micropipetas automáticas de 25 y 75 microlitros

• Puntas de pipeta desechable 

• Vaso de rechazo

Muestra

• Suero fresco 

Reactivos

• R1: Células Test (Hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con antígenos de T.pallidum)
• R2: Células control (suspensión estabilizada de hematíes de ave)
• R3: Diluyente ( Tampón fosfato, extracto de T.pallidum )
• Control +
• Control -

Procedimiento
- Método cualitativo

1. Atemperar los reactivos y la muestra a Tª ambiente
2. En la primera línea de la placa añadimos:

- Pocillo 1: 25 microlitros de muestra diluida al 1/20 y 75 microlitros de células control
- Pocillo 2: 25 microlitros de muestra diluida al 1/20 y 75 microlitros de células test

- Método semicuantitativo 

1. Hacemos diluciones dobles a partir de la dilución doble de la muestra. Para ello, utilizamos la línea 2 de la microplaca:

- Pocillo 1: 25 microlitros de diluyente y le añadimos 25 microlitros de muestra (1/20). Mezclamos con la pipeta y pasamos 25 microlitros al pocillo 2

- Pocillo 2: 25 microlitros de diluyente; mezclamos con los otros 25 (procedenete del pocillo 1) microlitros y pasamos 25 al pocillo 3.

- Pocillo 3: 25 microlitros de diluyente; mezclamos con los otros 25 microlitros  ( procedentes del pocillo 2) y pasamos 25  al pocillo 4.

- Pocillo 4: 25 microlitros de diluyente; mezclamos con los otros 25 microlitros ( procedentes del pocillo 3) y desechamos 25 microlitos al vaso de rechazo.

2. Cuando terminemos con las diluciones añadimos 75 microlitros de células test en todos los pocillos y mezclamos con la pipeta. 
3. Cubrimos la placa con parafilm y la agitamos suavemente hasta homogeneizar todas las mezclas.
4. Dejamos reposar unos 45 minutos 
5. Observamos macroscópicamente 

Resultados (lectura e interpretación)
En la placa podemos observar una capa de células lisas que recubre por completo el fondo de los pocillos, algunas veces con los borde replegados y algunas capas de células cubriendo parte del fondo del pocillo.