Práctica 4: Serodiagnóstico de la toxoplasmosis por hemoaglutinación indirecta

el
Serodiagnóstico de la toxoplasmósis por hemoaglutinación indirecta

Objetivo
El objetivo de la prueba es permitir la determinación cuantitativa de anticuerpos séricos dirigidos contra Toxoplasma gondii por hemoaglutinación indirecta

Fundamento
La prueba se basa en el principio de la hemoaglutinación indirecta. Los hematíes sensibilizados están constituidos por hematíes de ovino recubiertos por un antígeno toxoplasmático. Esta técnica permite detectar las IgG y las IgM anti-toxoplasmáticas. Es posible diferenciarlos tratando el suero con 2-mercaptoetanol el cual inhibe el poder aglutinante de las IgM. 
La presencia de anticuerpos anti-Toxoplasma gondii séricos provoca una aglutinación de los hematíes sensibilizados que se traduce en un velo rojo/marrón que tapiza el pocillo. En ausencia de anticuerpos específicos, estos hematíes se sedimentan en el fondo del pocillo como un anillo. 
Los hematíes no sensibilizados aseguran la especificidad de la reacción y permite eliminar las interferencias debidas a las aglutininas naturales anti-ovino. 

Materiales
  • Micropipetas de 50 microlitros
  • Puntas de pipeta desechables 
  • Vaso de rechazo 
  • Placas microtiter con el fondo en U
  • Tubos para hemólisis
  • Pipeta graduada y auxiliar de pipeteo



Muestra 
  • Suero de toxoplasmosis


Reactivos
  • Tampón fosfato pH 7,2
  • Hematíes sensibilizados (origen animal)

  • Hematíes no sensibilizados (origen animal)


Procedimiento 
  1. Preparamos la dilución madre 1/40 del suero a analizar. Para prepara la dilución, debemos depositar 50 microlitros de suero y 1,95 mL de tampón fosfato en un tubo de hemólisis y mezclamos.
  2. Con la ayuda de una micropipeta depositamos 50 microlitros de tampón fosfato en los primeros 8 pocillos
  3. Dispensamos 50 microlitros de la dilución madre de suero en el primer pocillo, a continuación mezclamos con el tampón y transferimos 50 microlitros del primer pocillo al segundo y así sucesivamente hasta el 6º pocillo. 
  4. Cuando lleguemos al 6º pocillo, desechamos los 50 microlitros.
  5. Depositamos 50 microlitros de la dilución madre en el 7º pocillo, mezclamos con el tampón y descartamos 50 microlitros. Esta dilución 1/80 constituye el suero control, cuyo papel es detectar las aglutininas naturales anti-ovino que pueden contener ciertos sueros. 
  6. A continuación agitamos cuidadosamente las suspensiones de hematíes.
  7. Depositamos 1 gota de hematíes sensibilizados en los 6 primeros pocillos y depositamos 1 gota de hematíes no sensibilizados en el 7º pocillo. 
  8. Depositamos 1 gota de hematíes sensibilizados en el 8º pocillo (reactivo control) cuyo papel es controlar la validez del tampón y de los hematíes sensibilizados. 
  9. Homogeneizamos muy cuidadosamente el contenido de los pocillos golpeando la placa con la mesa (debe estar plana)
  10. La tapamos con parafilm y la dejamos en la mesa (sin moverla) durante 2 horas. 










Resultado
Finalmente podemos observar que hay ausencia total de aglutinación, ya que podemos ver un anillo en el fondo del pocillo y no un velo rojo/marrón; por lo tanto la reacción es negativa. 
Como la reacción es negativa, el título es menor de 1/80. 
Como posibles errores tenemos: 
- Dilución del suero 
- Pipeteo incorrecto
- Defectos en los hematíes 

Nuestra placa:
Placa con reacción positiva título de 1/160



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