Determinación cuantitativa de inmunoglobulina M
Objetivo
Nuestro objetivo es realizar un ensayo turbidimétrico para la cuantificaicióm de IgM en suero o plasma.
Fundamento
Los anticuerpos anti-IgM forman compuestos insolubles cuando se combinan con la IgM de la muestra del paciente, ocasionando un cambio de absorbancia proporcional a la concentración de IgM en la muestra y que puede ser identificada por comparación con un calibrador de IgM de concentración conocida.
Significado clínico
La IgM es la única inmunoglobulina que sintetiza el recién nacido. En adultos representa el 5-10% del total de inmunoglobulinas. Su estructura es pentamérica y su elevado peso molecular evita su paso a espacio extravasculares.
Su concentración se halla disminuida en enfermedades relacionadas con deficiencias hereditarias o adquiridas de la producción de inmunoglobulinas.
La respuesta normal a las infecciones consiste en aumentar la producción de inmunoglobulinas. La IgM generalmente aumenta en infecciones víricas e infecciones del torrente circulatorio como la malaria y la cirrosis biliar primaria. En caso de mieloma múltiple, si la paraproteína es una IgM, probablemente se trata de una macroglobulinemia de Waldenströn. Las crioglobulinemias de origen monoclonal, son generalmente debidas a las IgM.
Su concentración se halla disminuida en enfermedades relacionadas con deficiencias hereditarias o adquiridas de la producción de inmunoglobulinas.
La respuesta normal a las infecciones consiste en aumentar la producción de inmunoglobulinas. La IgM generalmente aumenta en infecciones víricas e infecciones del torrente circulatorio como la malaria y la cirrosis biliar primaria. En caso de mieloma múltiple, si la paraproteína es una IgM, probablemente se trata de una macroglobulinemia de Waldenströn. Las crioglobulinemias de origen monoclonal, son generalmente debidas a las IgM.
Materiales
- Tubos de hemólisis de 3 mL
- Micropipeta de 100 y 1000 microlitros
- Puntas de pipetas desechables
- Cubetas de espectofotometría
Muestra
- Suero o plasma fresco
Reactivo
- Diluyente (R1)- Tampón tris 20
- Anticuerpo (R2)- Suero de cabra, anti IgM humana
- Suero salino fisiológico
Aparataje
- Espectofotómetro
- Baño termostatizado
Procedimiento
1. Atemperar los reactivos a Tª ambiente
2. Encender el espectofotómetro para calibrarlos
3. Preparamos las primeras diluciones en los 6 tubos:
- Tubo 1: 100 microlitros de ClNa
- Tubo 2: 10 microlitros de calibrador + 90 microlitros de ClNa
- Tubo 3: 25 microlitros de calibrador + 75 microlitros de ClNa
- Tubo 4: 50 microlitros de calibrador + 50 microlitros de ClNa
- Tubo 5: 75 microlitros de calibrador + 25 microlitros de ClNa
- Tubo 6: 100 microlitros de calibrador
4. Preparamos otros 6 tubos de hemólisis y añadimos en todos los tubos: 800 microlitros del reactivo R1 y 10 microlitros del calibrador anteriormente preparado cada uno a su correspondiente tubo.
5. Medimos las absorbancias de todos los tubos, pero previamente hacemos el blanco con agua destilada.Mezclamos y leemos las absorbancias que nos dan:
- Tubo 1: 0,194 A1
- Tubo 2: 0,187 A1
- Tubo 3: 0,223 A1
- Tubo 4: 0,248 A1
- Tubo 5: 0,217 A1
- Tubo 6: 0,224 A1
6. A los tubos preparados que les hemos leído las absorbancias, que contienen 800 microlitros de R1 y 10 microlitros de calibrador, añadimos 200 microlitros de reactivo R2 en cada tubo.
7. Esperamos 2 minutos y medimos las absorbancias:
- Tubo 1: 0,233 A2
- Tuno 2: 0,321 A2
- Tubo 3: 0,430 A2
- Tubo 4: 0,548 A2
- Tubo 5: 0,591 A2
- Tubo 6: 0,652 A2
8. Realizamos los cálculos para obtener las absorbancias finales:
A2-A1= Absorbancia total
9. Después de los cálculos haremos un tubo con muestra problemas, que son sueros de concentración desconocida
10. Preparamos dos tubos de sueros problemas, en el que añadimos:
- 800 microlitros de reactivo R1
- 10 microlitros de del suero de concentración desconocida
11.Medimos la absorbancias de los dos tubo, que nos dan:
- Tubo 1: 0,141 A1
- Tubo 2: 0,329 A1
12. A cada tubo añadimos 200 microlitros de reactivo R2
13. Esperamos 2 minutos
14. Medimos las absorbancias de estos tubos:
- Tubo 1: 0,515 A2
- Tubo 2: 0,575 A2
15. Hacemos los cálculos para conocer la absorbancia final:
A2-A1= Absorbancia total
16. Hacemos la gráfica y añadimos las dos absobancias problemas de concentración desconocida
Cálculos
Primeras absorbancias:
A2-A1:
- Tubo 1: 0,233 - 0,194= 0,039
- Tubo 2: 0,321 - 0,187=0,134
- Tubo 3: 0,430 - 0,223=0,207
- Tubo 4: 0,548 - 0,248=0,3
- Tubo 5: 0,591 - 0,217=0,375
- Tubo 6: 0,652 - 0,224=0,428
Concentraciones:
Las concentraciones se calculan multiplicando la concetración del calibrador por los factores de las diluciones de los primeros tubos.
Concentración del calibrador: 259 mg/dL
- Tubo 1: 0 mg/dL
- Tubo 2:25,9 mg/dL
- Tubo 3: 64,75 mg/dL
- Tubo 4: 129,5 mg/dL
- Tubo 5: 144,25 mg/dL
- Tubo 6: 259 mg/dL
Absorbancias del suero problema:
A2-A1=
- Tubo 1: 0,515 - 0,141= 0,374
- Tubo 2: 0,575 - 0,329= 0,246
1. Atemperar los reactivos a Tª ambiente
2. Encender el espectofotómetro para calibrarlos
3. Preparamos las primeras diluciones en los 6 tubos:
- Tubo 1: 100 microlitros de ClNa
- Tubo 2: 10 microlitros de calibrador + 90 microlitros de ClNa
- Tubo 3: 25 microlitros de calibrador + 75 microlitros de ClNa
- Tubo 4: 50 microlitros de calibrador + 50 microlitros de ClNa
- Tubo 5: 75 microlitros de calibrador + 25 microlitros de ClNa
- Tubo 6: 100 microlitros de calibrador
4. Preparamos otros 6 tubos de hemólisis y añadimos en todos los tubos: 800 microlitros del reactivo R1 y 10 microlitros del calibrador anteriormente preparado cada uno a su correspondiente tubo.
5. Medimos las absorbancias de todos los tubos, pero previamente hacemos el blanco con agua destilada.Mezclamos y leemos las absorbancias que nos dan:
- Tubo 1: 0,194 A1
- Tubo 2: 0,187 A1
- Tubo 3: 0,223 A1
- Tubo 4: 0,248 A1
- Tubo 5: 0,217 A1
- Tubo 6: 0,224 A1
6. A los tubos preparados que les hemos leído las absorbancias, que contienen 800 microlitros de R1 y 10 microlitros de calibrador, añadimos 200 microlitros de reactivo R2 en cada tubo.
7. Esperamos 2 minutos y medimos las absorbancias:
- Tubo 1: 0,233 A2
- Tuno 2: 0,321 A2
- Tubo 3: 0,430 A2
- Tubo 4: 0,548 A2
- Tubo 5: 0,591 A2
- Tubo 6: 0,652 A2
8. Realizamos los cálculos para obtener las absorbancias finales:
A2-A1= Absorbancia total
9. Después de los cálculos haremos un tubo con muestra problemas, que son sueros de concentración desconocida
10. Preparamos dos tubos de sueros problemas, en el que añadimos:
- 800 microlitros de reactivo R1
- 10 microlitros de del suero de concentración desconocida
11.Medimos la absorbancias de los dos tubo, que nos dan:
- Tubo 1: 0,141 A1
- Tubo 2: 0,329 A1
12. A cada tubo añadimos 200 microlitros de reactivo R2
13. Esperamos 2 minutos
14. Medimos las absorbancias de estos tubos:
- Tubo 1: 0,515 A2
- Tubo 2: 0,575 A2
15. Hacemos los cálculos para conocer la absorbancia final:
A2-A1= Absorbancia total
16. Hacemos la gráfica y añadimos las dos absobancias problemas de concentración desconocida
Cálculos
Primeras absorbancias:
A2-A1:
- Tubo 1: 0,233 - 0,194= 0,039
- Tubo 2: 0,321 - 0,187=0,134
- Tubo 3: 0,430 - 0,223=0,207
- Tubo 4: 0,548 - 0,248=0,3
- Tubo 5: 0,591 - 0,217=0,375
- Tubo 6: 0,652 - 0,224=0,428
Concentraciones:
Las concentraciones se calculan multiplicando la concetración del calibrador por los factores de las diluciones de los primeros tubos.
Concentración del calibrador: 259 mg/dL
- Tubo 1: 0 mg/dL
- Tubo 2:25,9 mg/dL
- Tubo 3: 64,75 mg/dL
- Tubo 4: 129,5 mg/dL
- Tubo 5: 144,25 mg/dL
- Tubo 6: 259 mg/dL
Absorbancias del suero problema:
A2-A1=
- Tubo 1: 0,515 - 0,141= 0,374
- Tubo 2: 0,575 - 0,329= 0,246
Gráfica
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